Hintergrund
Next-Generation Sequencing (NGS) Verfahren sind mittlerweile ein fester Bestandteil von Diagnostik und Pathogencharakterisierung und werden auch zur Detektion von Zoonose-Erregern eingesetzt. Im Projekt ZooSeq sollen Protokolle für die einzelnen Arbeitsschritte des NGS gesammelt, zusammengeführt, weiterentwickelt und zur Verfügung gestellt werden. Das Projekt dient der Etablierung modernster, effizienter Workflows, für Bakteriologie und Virologie gleichermaßen, basierend auf der Kompetenz und Expertise der NGS-erfahrenen Antragsteller. Die optimierten Sequenziermöglichkeiten (SOPs, Technologien, Pipelines) können dann von allen Zoonoseprojekten eingesetzt werden, um die NGS-basierte Forschung und Diagnostik im Forschungsnetz Zoonosen auf den bestmöglichen Stand zu bringen.
Obwohl die Erfahrungen mit NGS sehr umfangreich sind, gibt es immer noch Anwendungen, für die die Verfahren optimiert werden müssen. Das trifft zum einen zu, wenn spezielles Material bearbeitet wird, wie z.B. archiviertes FFPE-Material (Formalin-fixierte Paraffin-eingebettete Proben). Solche Proben sind für die phylogenetische Rekonstruktion der Erreger-Historie von großem Interesse. Zum anderen ist die Pathogen-Detektion oft erschwert, da der Erregeranteil in diagnostischem Probenmaterial natürlicherweise sehr gering ist. Da bei NGS-Methoden aber keine Vervielfältigung der Pathogen-Gensequenzen erfolgt, wird die Zielsequenz in NGS-Datensätzen oft von Wirtsnukleinsäuren sowie einer umfangreichen Begleitflora überdeckt. Im Projekt werden spezielle Methoden entwickelt mit denen man einerseits das Pathogen anreichern (Target-Enrichment-Methoden) oder andererseits eine Depletion der Wirtsnukleinsäuren erreichen kann. Somit soll das Wirt-Pathogen-Verhältnis zu Gunsten einer verbesserten Pathogen-Detektion verschoben werden. Ein weiterer Aspekt, der ebenfalls Evaluierung und breiter Etablierung bedarf, betrifft die Sequenziertechnologien der 3. Generation. Diese ermöglichen die Generierung besonders langer Sequenzierreads, was die Erstellung großer Genome erleichtert. Alle genannten Weiterentwicklungen für die verschiedenen NGS Anwendungen erfordern ebenfalls Anpassungen der bioinformatischen Auswertung der generierten Datensätze.
Förderung
Verbundpartner
FLI - Friedrich Loeffler Institut Insel Riems, Institut für Virusdiagnostik (Koordination)
- Dr. Claudia Wylezich
- Prof. Dr. Martin Beer
- Dr. Dirk Höper
- Dr. Florian Pfaff
IMBBw - Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München (Ko-Koordination)
- PD Dr. Markus Antwerpen
- MSc Malena Bestehorn
RKI – Robert-Koch-Institut Berlin, Mikrobielle Genomik
- Dr. Torsten Semmler
- MSc Lennard Epping
HPI – Hasso-Plattner-Institut Potsdam
- Prof. Dr. Bernhard Renard
- Dr. Vitor C. Piro
Charité –Universitätsmedizin Berlin, Institut für Virologie
Arbeitspakete
Die Arbeitspakete (AP) sind eng verzahnt, was Informationsfluss und Berücksichtigung der wechselseitigen Abhängigkeiten aller Schritte sicherstellt. Relevante Protokolle für NGS-Methoden werden erfasst, überarbeitet, evaluiert und aktuelle Versionen jeweils als SOPs innerhalb des Netzwerkes verfügbar gemacht (AP1). In AP2 wird die Prozessierung von FFPE-Material als besonderes und wichtiges Material für NGS-Verfahren optimiert sowie eine universelle Methode zur Wirtsdepletion entwickelt, um Wirtsmoleküle in der Probe zu minimieren, welche die unbekannte Zielinformation des Erregers maskieren. In AP3 wird ein System weiterentwickelt, welches mittels eines Target-Enrichment-Prozesses eine Vielzahl bekannter, relevanter Zielspezies (virale und bakterielle Erreger) anreichert und damit deutlich besser analysierbar macht. In AP4 werden Sequenziermethoden der 3. Generation optimiert, um die Sequenzierung langer Sequenzierreads zu verbessern. In AP5 wird die bioinformatische Auswertung der in AP2-AP4 generierten Daten optimiert. Diese bioinformatische Analyse der generierten Daten führt wiederum zur Evaluierung der Labormethoden aus AP1.